細(xì)胞骨架（肌動(dòng)蛋白微絲；F-ACTIN）綠色熒光染色試劑盒
產(chǎn)品說明書
主要用途
細(xì)胞骨架（肌動(dòng)蛋白微絲；F-ACTIN）綠色熒光染色試劑是一種旨在使用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽
（phalloidin），探尋細(xì)胞骨架的絲狀肌動(dòng)蛋白的分布和局部定向變化狀況的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)
經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于各種活體細(xì)胞（動(dòng)物、人體、植物等）的細(xì)胞骨架裝配的檢
測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，反應(yīng)敏感，操作簡捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
肌動(dòng)蛋白（actin）是42KD 的球蛋白，構(gòu)成細(xì)胞骨架的微絲（microfilament）和肌肉收縮裝置的細(xì)肌絲（thin
filament），以及細(xì)胞膜表面?zhèn)巫悖╬seudopodia）和微絨毛（microvilli）。肌動(dòng)蛋白存在于所有真核生物細(xì)
胞中，且高度進(jìn)化保留，參與各種重要細(xì)胞功能，包括細(xì)胞遷移、細(xì)胞分裂、肌肉收縮、細(xì)胞形態(tài)維護(hù)、
膜轉(zhuǎn)運(yùn)（membrane trafficking） 等。哺乳動(dòng)物具有六種異構(gòu)體，分成α、β、γ三類。球狀肌動(dòng)蛋白（G-actin）
在生理?xiàng)l件下，組合成長絲聚合體，轉(zhuǎn)化為絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin），形成細(xì)胞骨架的微絲。肌動(dòng)蛋白的聚
合與解聚的動(dòng)態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞骨架裝配（cytoskeleton assembly）的主要參數(shù)之一。鬼筆環(huán)肽（phalloidin）
是一種由毒性菇類中分離的二環(huán)七肽（bicyclic heptapeptide）生物堿，與聚合的微絲（F-肌動(dòng)蛋白）結(jié)合，
因此通過異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可以體外探測細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白的分布和含量，據(jù)此分析
細(xì)胞骨架裝配的調(diào)控機(jī)制。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
固著液（Reagent B） 毫升
通透液（Reagent C） 毫升
封阻液（Reagent D） 毫升
染色液（Reagent E） 微升
復(fù)染液（Reagent F） 微升
產(chǎn)品說明書1 份
保存方式
保存染色液（Reagent E）和復(fù)染液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱
里，避免光照；有效保證6 月
用戶自備
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細(xì)胞脫離
*細(xì)胞培養(yǎng)液：用于中和胰蛋白酶的處理
15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5 毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器
2
（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作
熒光（共聚焦）顯微鏡：用于細(xì)胞熒光觀察
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下凍融。移取xx 微升通透液（Reagent C）到1.5 毫升離心
管，然后分別加入xx 微升染色液（Reagent E）和復(fù)染液（Reagent F），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置
于冰槽里，放進(jìn)暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。
一、直接法
1． 準(zhǔn)備1 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)6 孔板，內(nèi)置1 個(gè)細(xì)胞1 X 1 cm 大小的載玻片
2． 接種待測細(xì)胞培養(yǎng)，直至每孔鋪滿率達(dá)70％
3． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
4． 輕輕加上xx 微升清理液（Reagent A）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面
5． 小心抽去清理液（Reagent A）
6． 輕輕加上xx 微升固著液（Reagent B）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面
7． 置于冰槽里孵育30 分鐘
8． 小心抽去固著液（Reagent B）
9． 輕輕加上xx 微升通透液（Reagent C）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面
10．小心抽去通透液（Reagent C）
11．輕輕加上xx 微升封阻液（Reagent D）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面
12．室溫下孵育30 分鐘
13．小心抽去封阻液（Reagent D）
14．輕輕加上xx 微升清理液（Reagent A）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面
15．小心抽去清理液（Reagent A）
16．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟14 和15 一次
17．小心加上xx 微升染色工作液， 覆蓋樣品表面
18．在暗室里室溫下孵育60 分鐘
19．小心抽去染色工作液
20．輕輕加上xx 微升清理液（Reagent A）到細(xì)胞載玻片上，覆蓋樣品表面
21．小心抽去清理液（Reagent A）
22．封片
23．即刻在熒光（共聚焦）顯微鏡下進(jìn)行觀察（每個(gè)視野計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞）：激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長
530nm（F－肌動(dòng)蛋白染色）或激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長460nm（細(xì)胞核染色）――
綠色熒光顯示F-肌動(dòng)蛋白；藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核為圓環(huán)或橢圓狀
二、間接法
1． 準(zhǔn)備1 個(gè)25cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測細(xì)胞，直至鋪滿率達(dá)70％（約100 萬細(xì)胞數(shù)）
2． 小心移出細(xì)胞培養(yǎng)液到15 毫升錐形離心管（收集懸浮細(xì)胞）
3． 加入xx 毫升清理液（Reagent A），覆蓋細(xì)胞表面
3
4． 小心移出xx 毫升清理液（Reagent A）到15 毫升錐形離心管
5． 加入1 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿細(xì)胞表面
6． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育1 分種
7． 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
8． 加入3 毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
9． 移入到15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞可以由此步開始）
10．放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g
11．小心抽去上清液
12．加入xx 微升清理液（Reagent A），混勻
13．轉(zhuǎn)入到1.5 毫升離心管
14．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
15．小心抽去上清液
16．加入xx 微升固著液（Reagent B），混勻
17．置于冰槽里孵育30 分鐘
18．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
19．小心抽去上清液
20．加入xx 微升通透液（Reagent C），混勻
21．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
22．小心抽去上清液
23．加入xx 微升封阻液（Reagent D），混勻
24．室溫下孵育30 分鐘
25．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
26．小心抽去上清液
27．加入xx 微升清理液（Reagent A），混勻
28．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
29．小心抽去上清液
30．加入xx 微升染色工作液
31．用200 微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細(xì)胞顆粒群
32．在暗室里室溫下孵育60 分鐘
33．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
34．小心抽去上清液
35．加入xx 微升清理液（Reagent A），混勻
36．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
37．小心抽去上清液
38．加入200 微升清理液（Reagent A），混勻
39．即刻移取10 微升在載玻片上壓片
40．在熒光（共聚焦）顯微鏡下進(jìn)行觀察（每個(gè)視野計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞）：激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長530nm
（F-肌動(dòng)蛋白染色）或激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長460nm（細(xì)胞核染色）――
綠色熒光顯示F-肌動(dòng)蛋白；藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核為圓環(huán)或橢圓狀射
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為10 次操作
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2． 在整個(gè)操作過程中須戴手套，以防污染
3． 孵育時(shí)，必須避免光照
4． 建議檢測細(xì)胞量達(dá)106 細(xì)胞數(shù)為佳
5． 用戶可以根據(jù)情況，適度調(diào)整試劑用量
6． 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光分析，不宜超過1 小時(shí)
7． 注意：紫杉醇（PACLITAXEL），使F-肌動(dòng)蛋白含量增加，熒光增強(qiáng)
8． 本公司提供系列細(xì)胞骨架檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰